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| 類別 | 食品輸入及查驗登記 |
| 法規性質 | 法規命令 |
| 法規名稱 | 健康食品之延緩衰老功能評估方法 |
| 條文內容 | <p style="text-align: center;"><b><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 16pt;">健康食品之延緩衰老功能評估方法 <br></br></span></b></p><p style="margin: 0cm -7.7pt 0pt 0cm; text-align: right;"><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;"><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">920829</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">衛署食字第0920401629號公告</span> </span></p><p style="margin: 9pt 0cm 0pt;"><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">壹、前言 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">老化是許多分子、細胞及系統方面的一種效應改變。分子與細胞的老化是基因（內在）與環境（外在，如熱、冷、疾病、營養素缺乏等因素）所造成。而系統的老化是器官某部分的變化，最常見的是皮膚上的變化，例如變硬、變粗及生皺等。所以老化細分為功能上（function）、行為上（behavior）及外表上（performance）上的變化。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">老化現象是一種普遍性（universal）、進行性（progressive）、累積性（cumulative）及傷害性（deleterious）之內外因素所引發之生理衰退。由於生物個體間、不同人生階段或時期之老化步伐及表現不一，所以無法以單一或簡單的模式來加以描述。也因為如此，隨年齡的增加，族群間之歧異（diversity/heterogeneity）也加大，增加很多複雜性。隨著年齡造成的生理功能衰退，有兩種情形，一為純粹與年齡增長有關之功能衰退（age-related physiologic deterioration），另一為出現伴隨年齡增長之疾病（age-associated disease），但兩者往往共同存在。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">老化學說大致上可分為兩類：基因預設（genetic program）與隨機破壞（stochastic）。前類學說認為預設的基因結構或基因表現的改變導致老化；另一類則將老化歸因於體內大分子物質像核酸、蛋白質隨時間所累積的隨機破壞超過體內的修復能力，這些隨機破壞可以來自自由基（free radical）、氧化作用（oxidation）或醣化作用（glycation）等。持平而論，老化可能是多種因子所共同參與的過程，而遺傳與各種環境因子亦都扮演舉足輕重的角色。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">關於老化的原因，迄今已提出的學說和意見不勝枚舉。其中最具信賴性的學說為自由基學說（free radical theory）。 自由基是指構成物質的原子團在分子狀態下有不成對電子的情形，這種電子結構極不穩定，易與其他分子發生反應。在所有自由基種類中，以含氧自由基對人體的健康最密切。它的產生方式有兩種：一種是由身體內正常新陳代謝所產生，即當細菌、黴菌、病毒或異物等入侵時，體內防衛系統在吞噬異物後，會產生「含氧自由 基」。另一種是受外界不正當因素的影響，例如輻射線或紫外線、抽菸、空氣污染等，甚至心理壓力也會形成含氧自由基。一但體內自由基的數量超出人體天然防禦的範圍，造成氧化壓力 (oxidative stress)， 則各種疾病與老化便接踵而至。因此，當自由基形成後就會造成連鎖反應，促使蛋白質、碳水化合物、脂肪、核酸等構成細胞物質的氧化，造成過氧化脂質的堆積，進而破壞體內的細胞膜、蛋白質及核酸等，使生理功能逐漸消失，產生疾病。若能增加生物體內抗氧化防禦系統之作用，以分解活性氧物質，則能有效減少細胞傷 害，延緩生物體的衰老與死亡。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">生物體內的抗氧化防禦系統大致可分為：一級防禦系統（primary defense system）及二級防禦系統（secondary defense system）。一級防禦系統如維生素Ｃ、維生素Ｅ、glutathione及抗氧化酵素如超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶及穀胱甘肽過氧化酶（glutathione peroxidase）等，其作用可直接清除活性氧物質或抑制活性氧物質之氧化；二級防禦系統包括脂質分解酵素（lipolytic enzyme）、蛋白質分解酵素（proteolytic enzyme）及DNA修復酵素（DNA repair enzyme）等，其負責清除活性氧物質之氧化性產物，修復受損的細胞及彌補在一級防禦系統中無法清除的自由基衍生物。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">在衰老學說中有一假說為「脂褐質累積」學說。脂褐質含30~70 %蛋白質，20~50 %脂質，4~7 %碳水化合物及微量金屬。其主要堆積在有絲分裂後的細胞，例如神經元、心肌細胞、視網膜細胞等。脂褐質是經由蛋白質的水解及多元不飽和脂肪酸氧化後之產物，亦是脂質氧化和糖化作用的聚合物，故可以利用periodic acid-schiff stain 和Sudan black B等特殊染色劑的染色後經過組織切片進行特異性標識。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">過去二十年有關老化機制（mechanism of aging）的理論與資料眾多，每一種理論很難以一種簡單、直接的方式，明白解釋原因與結果之間的關係。因而老化研究的目的乃在：(1) 檢測老化的經常性或一般性之持續變化；(2) 確認某些變化來自老化而非來自疾病，界定健康與疾病的分野；(3) 了解老化現象的根本原因及伴隨老化而來的疾病。並將所得到的結果分析作綜合研判，建立基本資料庫，以得到新的發現或發掘新的問題。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">貳、實驗項目與實驗方法 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">一、動物實驗 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">一) 生存實驗 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">利用生物的整個生存過程來觀察受試物對壽命的影響。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(1)</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">小鼠生存實驗 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">1.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">條件：選用小鼠12月齡小鼠，每組40隻，雌雄各半； </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">2.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">分組：隨機分成1個正常對照組和3個實驗劑量組，其中一組為人體每公斤體重每日推薦攝取量，小鼠擴大10倍 (必要時得依受試物之特性另定之)，作為其中1個劑量，以此為基礎，另設兩個劑量。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">3.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">實驗方法：一般用灌胃法，摻入飼料法或加入飲水法給予受試物，從12月齡開始給予，直到死亡。然後每天統計其死亡鼠數，直至全部自然死亡。比較實驗組與對照組的平均壽命和最高壽命，畫出其生存曲線圖，計半數動物死亡的天數。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(2)</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">大鼠生存實驗 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">1.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">條件：選用大鼠18月齡大鼠，每組30隻，雌雄各半； </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">2.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">分組：如同小鼠生存實驗，但其中一組為人體每公斤體重每日推薦攝取量大鼠擴大5倍。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">3.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">實驗方法：如同小鼠生存實驗，從18月齡開始給予，直到死亡。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(3)</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">果蠅生存實驗 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">1.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">條件：選用果蠅Oregen品系，雌雄分組，每個分組雌雄果蠅各200隻，分裝在10個培養管內，每管20隻。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">2.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">分組：需有四種劑量組，受試物推薦劑量＝每天每人推薦攝入量(g)/3000×100 %，以此濃度為中間劑量，按3倍組距上下各設1或2個劑量組。若受試物處理時使用了普通培養基中未使用的溶劑，則還應另設1個溶劑對照組。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">3.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">實驗方法：收集羽化後8小時內未交配的果蠅進行分組，用二氧化碳氣體麻醉，待果蠅完全麻醉後倒出，雌雄分組，每個分組雌雄果蠅各200隻，分裝在10個培養管內，每管20隻。每個劑量組均應準備2～3管裝有相同數目果蠅的後備管，作為遇到特殊情況時的補充。成蟲從分窩2週後開始並重新給予受試物(雌雄果蠅按培養管分別秤重，計算平均體重)。果蠅放入受試物培養基後實驗即正式開始，每天定時觀察紀錄果蠅的死亡數，每4天更換一次培養基，一直觀察到果蠅全部死亡。實驗結束，計算半數死亡天數，平均壽命和平均最高壽命 (每組最後死的20隻果蠅的平均存活天數為該組的最高壽命)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">二) 生化實驗 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">1. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">動物選擇：老齡動物、過氧化損傷處理動物或國際認可之老化模型動物任選其一。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">2. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">劑量分組及受試物試驗期間： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">設1個空白對照組，1個模型對照組及3個受試物劑量組，根據人體每日每公斤體重推薦攝取量，小鼠擴大10倍 (大鼠擴大5倍)，必要時得依受試物之特性另定之，作為其中1個劑量，以此為基礎，另設2個劑量。每組大鼠單一性別8-10隻，小鼠單一性別10-15隻。受試物經口連續至少給予30天，視研究必要可延長實驗期間。3個劑量組經口給予不同濃度受試物，模型對照組和空白組給予同體積溶劑。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">3. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">實驗方法： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(1) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">老齡動物 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">選用15月齡大鼠、12月齡小鼠，按血中MDA水平分組，隨機分為1個老齡對照組和3個受試物劑量組，另增設1個少齡對照組 (大鼠3月齡，小鼠8週)，30天後犧牲動物測氧化指標和生化指標。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(2) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">過氧化損傷模型動物 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(A) D-</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">半乳糖模型： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> a. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">原理：D-半乳糖供給過量，大量產生活性氧，打破了受控於遺傳模式的活性氧產生與消除的平衡狀態，引起過氧化效應。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> b. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">動物模型方法：選3月齡健康成年的小鼠，用D-半乳糖1.2 g/kg.bw頸背部皮下注射模型，注射量為0.1ml/10g.bw，每日1次，連續6週，取血測MDA，按MDA水平隨機分組，如上述之分組方式。在給受試物同時，除空白對照組外，各組繼續給予D-半乳糖1.2g/kg.bw頸背部皮下注射，空白對照組皮下注射生理鹽水，30天後，犧牲動物測氧化指標和生化指標。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(B) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">輻照模型： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> a. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">原理：電離輻射通過直接破壞生物膜中不飽和脂肪酸和間接通過水輻解產生自由基，引發脂類過氧化。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> b. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">動物模型方法：選18-22 g健康成年小鼠，隨機分5個組，如上述之分組方式。30天後，除空白對照組外，各組給予5-8Gy<sup>60</sup>Coγ射線全身一次性照射，照射後第3、4天犧牲動物，取肝組織 (或第9、10天犧牲動物，取睪丸組織) 測氧化指標和生化指標。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(C) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">溴代苯模型： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">選18-22g健康成年小鼠，隨機分5個組，如上述之分組方式。30天後，動物禁食過夜，給受試物0.5-1小時後，除空白對照組外，各組灌胃0.3 mol/L溴代苯油，灌胃量0.2 ml/20g.bw，空白對照組灌胃同體積植物油，大約18-22小時後犧牲動物，取肝組織測氧化指標和生化指標。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(3) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">老化模型動物 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">依國際認可老化模型動物之特徵，選用適當月齡之小鼠，分1個老齡對照組和3個受試物劑量組，另增設1個少齡對照組。30天後，犧牲動物測氧化指標和生化指標。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">二、人體實驗 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 1. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">背景說明： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">一 種健康食品必須以科學方法證明可延緩人體內至少一個以上器官功能衰老的速率或延長服用者之壽命，才能充分取信大眾此食品確有抗老防衰之效能。由於不同器官衰老的速率與原因未必相同，即使證明某食品可延緩甲器官老化，也不可據以推論此食品也延緩乙器官老化，必須針對不同器官逐一求證才符合科學之精神，但研究 者可同時觀測多個器官功能隨老化所發生之變化。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 2. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">計畫執行單位： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">需委託國內外大學食品、營養、醫藥等相關研究所或醫學中心執行，需有臨床試驗專家或醫師參與，並遵循衛生主管機關有關人體試驗之規定。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 3. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">受試食品： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">必須有科學文獻佐證其成分具有延緩器官功能衰老或延長壽命之效能，並經健康食品安全性評估方法證明在有效劑量範圍對人體不會有顯著急、慢性不良反應。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 4. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">受試者： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">未服用任何藥物身心健康之成年人，需包括部分老年人 (六十五歲以上) ，需有對照組與實驗組，每組不少於二十人，由臨床試驗專家視實驗特性與設計之需要，依學理推算適當之受試人數，以免樣本太小無法統計。受試者須被充分告知試用食品之可能不良反應，並簽立同意書，才能收案。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 5. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">觀察指標之選定： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">實驗設計者依其所欲證明可延緩老化之器官，並參酌以往科學文獻評估該器官功能之方法，決定所需觀察之效能指標。例如：使用肌酸酐廓清率來評估腎絲球功能，使用FEV<sub>1</sub>來評估肺功能。針對每一器官選定之指標項目愈多，且每一指標皆因測試食品之使用而改善，則說服力愈強。此外，也必須訂有不良反應之觀察指標。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 6. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">試驗流程： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">收集受試者基本資料與所有觀察指標之基礎值後，實驗組投予試用食品，對照組服用安慰劑至少六個月。安慰劑之外型應力求與試用食品相同。試驗期間與期終需追蹤觀察指標若干次。期滿後兩組對調，原對 照組改服試用食品，實驗組改服安慰劑，重複整套觀察流程一次。觀察期間之設定由臨床試驗專家依每一器官老化之速率，食品之效能與受試者之特性推估而定。實驗過程宜採雙盲方式進行，開方者與受試者不知服食之內容。受試者並應避免干擾觀察指標之因子。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">三、判定基準： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(1) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">動物實驗 (生存及生化) 與人體實驗都要做。若人體試驗沒顯著延緩衰老效果，但動物實驗看到有不錯的結果，建議可允許標示為〝在動物實驗表明有延長生命作用〞。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(2) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">動物之生存實驗可簡化，果蠅不用做 (因為不是哺乳動物)，其中大鼠或小鼠之材料可選其中之一項即可。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(3) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">人體實驗可多加功能性的血液檢查。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">參、生化實驗測定項目 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">一、氧化指標 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">一) 氧化修飾後蛋白羰基功能基含量測定<sup>1-3</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(1) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">分光光度測定法： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">取血清或腦脊液 (serum or CSF)，並將樣品先行將核酸去除。檢體先在6000 g離心10分鐘，當280/260 nm波長之比率小於1.0時，表示核酸含量多。故檢體必須加入10% streptomycin sulfate 直到其最終濃度為1%。試管放置於常溫10分鐘，而後在 6000 g離心。將上清液與沈澱物(precipitate)分開，分析步驟如下： </span></p><table style="margin: auto auto auto 64.4pt; border: currentcolor; border-collapse: collapse;" border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"> <tbody> <tr> <td valign="top" style="border-width: 1pt medium; border-style: solid none; border-color: windowtext rgb(236, 233, 216); padding: 0cm 1.4pt; width: 126pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">試 劑 </span></p> </td> <td valign="top" style="border-width: 1pt medium; border-style: solid none; border-color: windowtext rgb(236, 233, 216); padding: 0cm 1.4pt; width: 81pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">空 白 管 </span></p> </td> <td valign="top" style="border-width: 1pt medium; border-style: solid none; border-color: windowtext rgb(236, 233, 216); padding: 0cm 1.4pt; width: 142.7pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">樣 品 管 </span></p> </td> </tr> <tr> <td valign="top" style="border-width: medium medium medium 1pt; border-style: none none none dashed; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) rgb(153, 153, 153); padding: 0cm 1.4pt; width: 126pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">萃取蛋白 </span></p> </td> <td valign="top" style="border-width: medium medium medium 1pt; border-style: none none none dashed; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) rgb(153, 153, 153); padding: 0cm 1.4pt; width: 81pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">1.0 c.c. </span></p> </td> <td valign="top" style="border-width: medium 1pt; border-style: none dashed; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(153, 153, 153); padding: 0cm 1.4pt; width: 142.7pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">1.0 c.c. </span></p> </td> </tr> <tr> <td valign="top" style="border-width: 1pt medium medium 1pt; border-style: dashed none none dashed; border-color: rgb(153, 153, 153) rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) rgb(153, 153, 153); padding: 0cm 1.4pt; width: 126pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">10 mM DNPH (in 2.5 M HCl) </span></p> </td> <td style="border-width: 1pt medium medium 1pt; border-style: dashed none none dashed; border-color: rgb(153, 153, 153) rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) rgb(153, 153, 153); padding: 0cm 1.4pt; width: 81pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">- </span></p> </td> <td valign="top" style="border-width: 1pt 1pt medium; border-style: dashed dashed none; border-color: rgb(153, 153, 153) rgb(153, 153, 153) rgb(236, 233, 216); padding: 0cm 1.4pt; width: 142.7pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">4.0 c.c. </span></p> </td> </tr> <tr> <td valign="top" style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 126pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">2.5 M HCl </span></p> </td> <td valign="top" style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 81pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">4.0 c.c. </span></p> </td> <td valign="top" style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 142.7pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">- </span></p> </td> </tr> <tr> <td valign="top" style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 349.7pt; background-color: transparent;" colspan="3"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">混勻，避光常溫培育 60 min，每15分鐘 vortex一次 </span></p> </td> </tr> <tr> <td valign="top" style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 126pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">20% TCA (w/v) </span></p> </td> <td valign="top" style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 81pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">5.0 c.c. </span></p> </td> <td valign="top" style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 142.7pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">5.0 c.c. </span></p> </td> </tr> <tr> <td valign="top" style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 349.7pt; background-color: transparent;" colspan="3"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">放置於冰浴10分鐘，離心5分鐘，上清液棄除，收集沈澱，以4.0 c.c.的ethanol/ethyl acetate清洗3次，棄除未經作用之過剩DNPH以及脂肪。 </span></p> </td> </tr> <tr> <td valign="top" style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 126pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">6 M guanidine hydrochloride </span></p> </td> <td style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 81pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">2.0 c.c. </span></p> </td> <td style="border-width: medium medium 1pt; border-style: none none solid; border-color: rgb(236, 233, 216) rgb(236, 233, 216) windowtext; padding: 0cm 1.4pt; width: 142.7pt; background-color: transparent;"> <p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">2.0 c.c. </span></p> </td> </tr> </tbody></table><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">加入上述試劑可將沈澱物溶解。Vortex混勻並放置常溫10分鐘。若有不沈澱之雜質，用離心法將之棄除。每一樣品要在335-390 nm 波長掃描 (以空白管做為blank)，羰基含量可以最大吸光之吸光度(peak absorbance)求取之(以吸光係數ε=22,000 M<sup>-1</sup>C<sup>-1</sup>計算濃度)。同時，樣品管之蛋白量要以280 nm之吸光度求取之。最後配合樣品管之蛋白量，即可換算成nmol/mg之羰基量。故總羰基量可以下式求取之： </span></p><p style="text-align: center;"><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">組織之羰基量測定： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">步驟與上述相同，但要事先做組織之homogenization。將150-200 mg組織放入塑膠盤(plastic dishes)，加入3.0 c.c. homogenizing buffer。用剪刀將組織剪成細片，常溫放置15分鐘，將含蛋白之溶液分離，並在6000 g離心，將雜質去除。用280/260 nm之比率判別是否含核酸太高。如果太高，則用streptomycin sulfate去除。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (2) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">高效率層析測定法 (High-performance liquid chromatography)： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">使用TCA或硫酸胺 (ammonium sulfate) 濃縮獲取沈澱物。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">將沈澱物分為兩組，其中一組充當derivatization blank，另一組樣品則用來做derivatization。將樣品放於有蓋之1.5 ml塑膠試管。加入3倍體積之derivatization試劑，混勻，藉以溶解樣品。放置在常溫15-30分鐘。使用in-line之濾網棄除不溶物。將樣品注射進入儀器分析條件：HPLC column: Column :Zorbax GF450 (Mac-Mod analytical, Chadds Ford, PA, USA or Dionex, Sunnyvale, CA. USA)；Mobile phase (6.0 M Guanidine hydrochloride, 0.5 M potassium phosphate pH 2.5)；flow rate: 2 min/ml；注意波長276及370 nm之層析圖譜。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">計算： </span></p><p style="margin: 0cm 0cm 12pt;"> </p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">二) 測定血漿蛋白含硫功能基及谷胱甘肽<sup>4-6</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(1)</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">血漿全部含硫功能基之測定 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">方法：0.20 ml之plasma放置於1-ml試管中，依序加入0.6 ml Tris-EDTA buffer (Tris base 0.25 M, EDTA 20 mM), pH 8.2., 40 µl 10 mM DTNB及3.16 ml絕對甲醇 (Absolute methanol)。將所有試管以管蓋蓋住，等待呈色產生(15-20分鐘)。在3000 g離心10分鐘 (常溫狀況下)。讀取上清液之吸光度 (412 nm；A) 減去DTNB之空白管吸光度 (B) 故全部之血漿含硫功能基是可由下式求取之： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> Total SH groups = (A – B – 0.03) x (4.0/0.2) / 13.6 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> = (A – B – 0.03) X 1.47 (mM)</span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> [Note: 0.03 = Sample blank</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">；吸光係數 = 13,600 M<sup>-1</sup> cm<sup>-1</sup>]</span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">方法：50 µl plasma + 1.0 ml Tris-EDTA，讀取吸光度 (A<sub>1</sub>)，加20 µl 10 mM DTNB於上管。在常溫放置15分鐘，再度讀取吸光度 (A<sub>2</sub>)，並測DTNB之空白管取光度 (B)</span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">則Total SH groups= (A<sub>2</sub> – A<sub>1</sub> – B) X (1.07/0.05) / 13.6 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> = (A<sub>2</sub> – A<sub>1</sub> – B) X 1.57 (mM) </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(2) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">血漿谷胱甘肽濃度測定： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">0.5 ml</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">血漿 + 0.5ml cold 10% TCA </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">放置於冰浴中10分鐘，並在3000 g離心15分鐘 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">0.2 ml</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">的上清液＋1.7 ml phosphate/EDTA buffer＋0.1 ml OPD試劑 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">放置於室溫15分鐘，測定螢光強度 (激發波長 = 350 nm；放光波長= 420 nm) </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">樣品之谷胱甘月太量，則可由GSH之標準曲線上換算求得 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">注意事項：抽煙之血漿檢體會干擾(A)及(B)之測定結果。棄除上述干擾之方法為先將血漿之蛋白 (50 µl) 用1 ml 5% TCA in 5 mM EDTA) 沈澱，再將沈澱物浮懸在Tris-EDTA buffer後，再做呈色反應。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">三) DNA之8羥基-2’-去氧鳥嘌呤核苷之高效率層析法之測定<sup>7,8</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(1) DNA</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">樣品之製備及水解 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(A) DNA</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">之萃取步驟： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">將1克之組織加入4c.c.之homogenizing buffer (0.3 M sucrose, 0.025 M Tris,0.002 M EDTA, final pH 7.3) 後做homogenization 10-15秒，加入同體積的DNA extraction solution [1.0 M LiCl, 2 M urea, 0.04 M sodium citrate, 0.005 M disodium EDTA, 2% sodium dodecyl sulphate (SDS), pH 6.8，此溶液並通過 0.45 µm membrane 過濾，且貯存在室溫]。RNA-free DNA, 加入RNase (100 µg/ml)在50℃條件下培育30分鐘，再加入proteinase K (100-300 µg/ml),在50℃條件下培育30-120分鐘，接著加入等體積chloroform/isoamyl alcohol (24/1)，使水相/有機相互相混合約15分鐘，2000-3000 g離心5分鐘使水相及有機相分開，取水相再重覆chloroform/isoamyl alcohol (24/1)萃取，至少三次。最後取水相，加入1/15體積之3 M sodium acetate (pH =5.3)及2-2.5倍體積之95%酒精，並在3,000～4,000 g條件下離心使核酸沈澱，沈澱的核酸以70﹪酒精清洗二次，然後Air dry樣品並將之溶於Tris/EDTA solution (0.010 M Tris，0.001 M EDTA，pH 7.4)。最後測定在260及280 nm之吸光度，並以260 nm之吸光度計算DNA濃度 (當260/280比值接近1.8時，則DNA不再含有蛋白)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (B) DNA</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">之水解(DNA digestion)： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">將DNA用0.25 ml Tris/EDTA溶解，加入0.025 ml 0.5 M sodium acetate，pH 5.1 以及 2.75 μl 1 M MgCl<sub>2</sub>，將上面混合液加熱至100℃ (水浴) 5分鐘(以製備單股DNA)，速將其放入冰浴5分鐘，加入10 µg nuclease P<sub>1</sub> (1 mg/ml之水液放置於4℃，可重覆稀釋使用)，並在37℃條件培育60分鐘，利用8 μl 1 M Tris base調節pH至7.8，加入2 μl (2 units) alkaline phosphatase 並在37℃條件下培育60分鐘，最後加入4 μl 5.8 M醋酸 (acetic acid) 使酵素沈澱。將混合液過濾 (0.2 µm HPLC filter)。濾過液將可注射至HPLC。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (2) HPLC-ED</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">方法偵測8-OHdG </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">利用Waters Associates (Milford, MA, USA) 510模式的solvent delivery system [含Rheodyne 7125 (Cotati, CA, USA) injector]及3 µm Supelcosil (B, PA. USA) LC-18-DB column (15 cm x 4.6 mm)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">Mobile phase [50 mM KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> buffer, pH 5.5</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">及甲醇(90:10 v/v)]。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">Flow rate</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">為0.8 ml/min (back pressure 2000 psi)。Samples are analyzed by separate UV [Kratos model 773 UV detector (Westwood, NI, USA)] and EC [Bioanalytical system (West Lafayette), IN, USA] LC-4B amperometric detection system [使用polytetrafluoro-ethylene CPTFE tubing]。 </span></p><p style="text-align: center;"><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">四) 以血球為模式評估抗氧化製劑對降低自由基氧化損傷評估方法<sup>9-12</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (1) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">全血離心後，將血漿及buffy coat棄除。紅血球以10 mM phosphate buffer, pH 7.4 (含135 mM NaCl) (PBS) 洗三次。再將血球加入PBS使其hematocrit約為10%。將製劑放入10% FCS [最後濃度為1:10<sup>5</sup>~10<sup>4</sup> (w/v)]，然後加入25 mM AAPH。另外一管則僅含10% FCS，亦加入25 mM AAPH做為control。將所有試管在37℃條件下培育6小時。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (2) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">分析項目：在定時 (1, 2, 3, 4, 5或6小時) 分別取出適量紅血球，同時測定四項指標。即 (A) 溶血度 (B) 血中谷胱甘月太量 (C) 脂質過氧化指標—MDA (D) SDS-PAGE胞膜蛋白型式。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">倘若製劑有保護作用，則以上四種指標與control比較會有明顯差異。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">五) 定量磷脂膽鹼過氧化氫 (Phosphatidylcholine hydroperoxide，PCOOH) 以及磷脂乙醇胺過氧化氫 (Phosphatidylethanolamine hydroperoxide，PEOOH)<sup>13</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (1) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">原理：PCOOH及PEOOH，乃是脂質過氧化作用的最初產物，利用超微弱化學發光儀 (Chemiluminescence-high Performance Liquid Chromatography，CL-HPLC)，使用後置管柱通入對過氧化物具有特異性的化學發光的試劑，也就是魯米諾 (Luminol) 和細胞色素丙 (cytochrome C) 的混合溶液來測此二產物，而且可以去除其他雜質，這種方法比測量TBARS更具有特異性。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (2) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">實驗方法： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (A) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">血漿磷脂過氧化氫之定量：1.0 ml血漿，加入4.0ml冰冷的CHCl<sub>3</sub>/甲醇 (2：1，V/V) 的萃取溶劑 (包含0.002 ﹪的BHT)，混合１分鐘，在3000 rpm下離心10分鐘，收集下層的氯仿，再加入1ml 0.15M NaCl，溶液到上層包含半固體介面的甲醇/水層，再重新用CHCl<sub>3</sub>/甲醇萃取下層CHCl<sub>3</sub>，用無水Na<sub>2</sub>SO<sub>3</sub> (大約1g) 脫水，用Toyo 5C 濾紙過濾，用氮氣吹乾，重新溶解在50 μl的CHCl<sub>3</sub>/甲醇 (2：1，V/V)，注入20 μl到CL-HPLC。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (B) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">老鼠肝及腦磷脂過氧化氫之定量：500 mg (淨重) 肝或腦，加入1.0 ml 0.15 M NaCl溶液 (包含0.002﹪ BHT) ，在冰冷的條件下用鐵氟龍－玻璃均質機均勻化，加入4.0 ml冰冷的氯仿/甲醇 (2：1，V/V) 溶液 (包含0.002﹪ BHT)，收集下層的CHCl<sub>3</sub>，再加入1 ml 0.15M NaCl，溶液到上層包含半固體介面的甲醇/水層，再重新用CHCl<sub>3</sub>/甲醇萃取下層的CHCl<sub>3</sub>，用無水Na<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>（大約1g）脫水，用Toyo 5C 濾紙過濾，用氮氣流體蒸發，重新溶解在100 μl的CHCl<sub>3</sub>/甲醇 (2：1，V/V) ，注入20 μl溶液到CL-HPLC。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(C) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">分析條件： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">管柱：TSK-Gel Silica 60（5 μm，250×4.6 mm，Toso Co. Tokyo，Japen） </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">移動相：CHCl<sub>3</sub>：CH<sub>3</sub>OH：n-propanol：H<sub>2</sub>O＝1：9：2：0.1（V/V） </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">幫浦１：1.1 ml/min </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">幫浦２：1.0 ml/min </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">化學發光試劑：（10 μg/ml） cytochrome C和 （1 μg/ml）魯米諾溶解在50 mM borate緩衝液（pH 9.3） </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">化學發光偵測器：TEIC CL OX-7分析儀（Tohoku Electronic Industries） </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"></span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">管柱：JASCO Finepak SIL NH<sub>2</sub>-5 (n-propylamine-bound Silica column 5 μm, 250×4.6 mm) </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">移動相：己烷／2-propanol/甲醇／水（5：7：2：1，V/V） </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">幫浦１：1.0 ml/min </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">幫浦２：1.1 ml/min </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">化學發光試劑：（10 μg/ml）cytochrome C和（2 μg/ml）魯米諾溶解在50 mM borate緩衝液（pH 10.0） </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">混合接頭溫度：40℃ </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">化學發光偵測器：TEIC CLD-110（試料室溫度40℃） </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">UV</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">吸收度在205 nm </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">六) HPLC- Fluorescence Detector方法偵測TBARS含量之測定<sup>14</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(1) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">細胞以PBS洗滌三次，再加入適量體積的PBS，全血離心後取血漿約0.05 ml。0.05 ml的樣品或標準品 (大約含0.1～20 mg蛋白質) 加入0.75 ml的phosphoric acid (0.44 M) 溶液混和均勻，再加入0.25 ml TBA (42 mM) ，加熱至95℃，60分鐘。冷卻後，離心9500g 10分鐘。取上清液0.5 ml再加入0.5 ml methanol-NaOH (4.5 ml 1N NaOH加methanol至50ml) 溶液混合均勻，取0.05 ml供HPLC儀器測量。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(2) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">標準品製備：0.05 ml 1,1,3,3-tetramethoxypropane (TPE) (purity 98﹪MW 220.3 Da) 以40 ﹪ethanol 配成25 ml stock solution，每月配製，保存4℃中。取0.5 ml stock solution以40 ﹪ethanol配成100 ml，再各取 0.375、0.75、1.5、3.0 ml以水配成25 ml，其濃度分別為0.61、1.22、2.43、4.86 新鮮配製。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(3) HPLC</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">分析條件： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">HPLC column: uBondpack C18 (39×300 mm) </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">Mobile phase (400 ml methanol</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">加上600 ml phosphate buffer 50 mM, pH6.8) </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">flow rate: 2 min/ml </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">Fluoresence detector: Ex=532 nm; Em=550 nm </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">七) 判定基準： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 1. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">六項氧化指標中，可任選三項做實驗，至少須要一組實驗為正反應 (positive data) ，並且不能有負相反應 (negative data)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 2. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">以上氧化指標之實驗方法，若有文獻或有其他科學方法佐證之，亦可採用。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">二、生化指標 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">測定項目：超氧化物歧化酵素、葡萄糖六磷酸去氫酵素、觸酵素、麩胱甘 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">肽過氧化酵素、麩胱甘肽還原酵素活性測定方法 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">樣本的準備： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (1) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">血漿和紅血球樣品：收集0.5-2 ml的血液入heparinized tube，輕輕的混合，並且立即離心 (1000 g，10 min，4℃)；可將血漿等分並存於-70℃，直到分析前。移除buffy coat並用約5倍體積的冰saline來洗紅血球兩次；在第二次清洗完後，加入約20倍體積的50 mM phosphate buffer，pH 6.6去溶解此紅血球 (此lysate可存於-70℃，直到分析前)；在分析前，加入等量的double-strength Drabkin’s試劑到hemolysate中，以轉換全部的haemoglobin成穩定的cyanmethaemoglobin型式，用於定量血紅素(haemoglobin)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> (2) </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">組織樣品：利用冰的0.25 M sucrose buffered with 10 mM HEPES，pH 7.4，或 1.15% KCl 在0.05 M phosphate buffer，pH 7.6來準備10%均質物 (homogenate)，並在4℃離心以獲得所需的細胞內物質 (可存於-70℃，直到分析前)；在使用前，利用超音波震盪或冷凍-解凍細胞內胞器2-3次。若所使用的組織，因其具有較高的酵素活性，進一步的稀釋為必要的。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">一) 超氧化物歧化酵素 (Superoxide dismutase，SOD) 活性之測定<sup>15-16</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">組織樣品製備如上述，取適量以供測量。紅血球lysate（備如上述）1 ml，加上0.4ml ethanol / chloroform後混和均勻，離心1000g，10分鐘，取萃取上清液待測。依序加入下列試劑：H<sub>2</sub>O 860μl、Tris buffer ( 0.5M Tris, pH 8.2 ) 100μl、樣品或SOD 標準品20μl 、pyrogallol (10 mM) 20μl，混和均勻後掃描波長420nm吸光度5分鐘，計算ΔOD / min，並對照標準品推算SOD活性。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">比活性表 (specific activity) 示法：SOD IU/mg of protein (or mg of hemoglobin)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">二) G6PD (Glucose-6-phosphate dehydrogenase) 活性測定 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">組織樣品或紅血球lysate製備如上述，取適量以供測量。依序加入下列試劑：H<sub>2</sub>O 590μl、Tris buffer(1.0 M, pH 8.0) 100μl、MgCl<sub>2</sub> (0.1M) 100μl、NADP(2mM) 100μl、樣品 10μl，混合後於37℃，3 min再加入100μl G6P(6mM)快速混合後於37℃波長340nm下測10分鐘內吸光值的變化。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">計算：IU / ml = (Δ340nm / min ÷6.22) / sample volume </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">IU</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">：係指在測定條件下，每分鐘能產生1μmole NADPH之酵素量。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">比活性表 (specific activity) 示法：G6PD IU/mg of protein (or mg of hemoglobin)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">三) 過氧化氫酵素 (Catalase) 活性測定方法<sup>17</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">組織樣品製備如上述，取適量以供測量。紅血球lysate（製備如上述）1 ml，加上0.4 ml ethanol / chloroform後混和均勻，離心1000g，10分鐘，取萃取上清液待測。依序加入下列試劑H<sub>2</sub>O 540 μl、Tris buffer (1M Tris, 5mM EDTA, pH 8.0) 100μl、saturated thymol 100μl、aminoantipyrine (10mM) 100μl、樣品或catalase 標準品10μl、peroxidase (1 U/ml) 100μl、saturated thymol H<sub>2</sub>O<sub>2</sub> 50μl。均勻混和後於波長505nm掃描其吸光度，取第五分鐘之吸光值。對照標準品吸光值曲線計算出樣品中catalase活性。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">比活性表 (specific activity) 示法：catalase IU/mg of protein (or mg of hemoglobin)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">四) 麩胱甘肽過氧化酵素 (Glutathione peroxidase，GSH Px) 活性之測定<sup>18</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">組織樣品或紅血球lysate製備如上述，取適量以供測量。配製coupling reagent 100 ml (2 mM EDTA、1 mM NaN<sub>3</sub>、1 mM GSH、0.2 mM NADPH、100 units GSH redutase、50 mM Tris-HCl buffer，pH 7.6，此試劑以新配為佳，可在室溫下6-8 小時或在4℃下24 小時；NaN<sub>3</sub>可抑制catalase活性)。再以50 mM Tris-HCl buffer(pH 7.6)配hydroperoxide substrate (1mM hydrogen peroxide以新配為佳、4.8 mM cumene hydroperoxide可存於-20℃ > 1個月)。每10-100 μl sample preparation加入965-875 μl of the coupling mixture在37 or 25℃下作用2-3分鐘；再加入25 μl of a hydroperoxide substrate開始反應 (無sample的blank values亦需測得)，觀察在波長340 nm其吸光值在1-2分鐘內的減少量 (亦即NADPH消失的速率)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">計算：IU / ml = (Δ340nm / min ÷6.22 ) / sample volume </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> IU</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">：係指在測定條件下，每分鐘能產生1μmole NADPH之酵素量。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">比活性表 (specific activity) 示法：GSH Px IU/mg of protein (or mg of hemoglobin)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">五) 麩胱甘肽還原酵素 (Glutathione reductase，GSH Rd) 活性之測定<sup>19</sup> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">組織樣品或紅血球lysate製備如上述，取適量以供測量。取sample 40 μl，GSSG(2.2 mM ) 100μl，NADPH (0.17 mM) 200μl混合於並測5分鐘內溫度37℃下，波長340nm吸光值的變化。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">GSH Rd activity</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">計算公式：U/L=4983×△A 340nm/min </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">比活性表 (specific activity) 示法：GSH Rd IU/mg of protein (or mg of hemoglobin)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">(</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">六) 判定基準： </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 1.</span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">五項生化指標中，至少須要三組實驗為正反應 (positive data)，並且不能有負相反應 (negative data)。 </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> 2. </span><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;">以上生化指標之實驗方法，若有文獻或有其他科學方法佐證之，亦可採用。 </span></p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"><br clear="all" style="page-break-before: always;"></br></span><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 13.5pt;"> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">參考資料 <br></br>1. Reznick AZ, Packer L. <i>Methods in Enzymology. 233:357-63, 1994.</i> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">2. Levine RL, Williams JA, Stadtman ER, Shacter E. <i>Methods in Enzymology. 233:346-57, 1994.</i> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">3. Levine RL, Garland D, Oliver CN. <i>Methods in Enzymology. 186:464-78, 1990.</i> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">4. Hu ML. <i>Methods in Enzymology. 233:380-5, 1994.</i> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">5. Hamvas A, Palazzo R, Kaiser L, Cooper J, Shuman T, Velazquez M, Freeman </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;"> B,Schuster DP. <i>Journal of Applied Physiology. 72:621-8, 1992.</i></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">6. Halliwell B, Gutteridge JM. <i>Archives of Biochemistry & Biophysics. 280:1-8, 1990.</i> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">7. Shigenaga MK, Park JW, Cundy KC, Gimeno CJ. <i>Methods in Enzymology. 186:521-530, 1990.</i></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">8. Maidt ML et al. Measurement of products of free radical attack on nucleic acid. In: punchard NA and FJ, eds. <i>Free Radicals—A practical approach.</i> Oxford University Press. Oxford, pp <i>201-209, 1996.</i></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">9. Zou CG, Agar NS, Jones GL. <i>Life Sciences. 69:75-86, 2001.</i></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">10. Beutler E et al. <i>J Lab Clin Med 61: 882-888, 1963</i>.</span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">11. Stocks J, Dormandy TL. <i>British Journal of Haematology. 20:95-111, 1971.</i> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">12. Laemmli UK. <i>Nature. 227:680-685, 1970.<br></br><br></br></i>13. Miyazawa T, Fujimoto K, Suzuki T, Yasuda K. <i>Methods in Enzymology. 233:324-32, 1994.</i></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">14. Wong SH, Knight JA, Hopfer SM, Zaharia O, Leach CN Jr, Sunderman FW Jr. <i>Clinical Chemistry. 33:214-220, 1987.</i></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">15. Marklund S, Marklund G. <i>European Journal of Biochemistry. 47:469-474, 1974.</i> </span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">16. Wang WT, LeDonne NC Jr, Ackerman B, Sweeley CC. <i>Analytical Biochemistry. 141:366-81, 1984.</i></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">17. Guemouri L, Artur Y, Herbeth B, Jeandel C, Cuny G, Siest G. <i>Clinical Chemistry. 37:1932-1937, 1991.</i></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">18. Paglia DE, Valentine WN. <i>Journal of Laboratory & Clinical Medicine. 70:158-169, 1967.</i></span></p><p><span style="color: rgb(51, 51, 51); font-family: 標楷體; font-size: 10pt;">19. Goldberg DM, Spooner RJ. in <i>Methods of Enzymatic Analysis</i> (Bergmeyen, H.V. Ed.)3<sup>rd</sup> edn. vol 3,pp <i>258-265, 1983.</i> Verlog Chemie, Deerfied Beach, Fl.</span></p> |
| 發佈日期 | 2003-08-29 |
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